Евразийский совет по стандартизации, метрологии и сертификации (еасс) euro-asian council for standardization, metrology and certification (easc)
|
5.3 Штаммы микроорганизмовИспытание необходимо производить, используя следующие штаммы в качестве экспериментальных микроорганизмов: - Pseudomonas aeruginosa ATCC®9027™2, равноценные штаммы: CIP®82.118™3, или NCIMB®8626™4, или NBRC®13275™5, или KCTC®2513™6, или другие равноценные местные коллекционные штаммы; - Staphylococcus aureus ATCC®6538™, равноценные штаммы: CIP®4.83™, или NCIMB®9518™, или NBRC®13276™ , или KCTC®3881™, или NCTC®10788™7, или другие равноценные местные коллекционные штаммы; - Escherichia coli ATCC®8739™, равноценные штаммы: CIP®53.126™, или NCIMB®8545™, или NBRC®3972™, или KCTC®2571™, или NCTC®12923™, или другие равноценные местные коллекционные штаммы; - Candida albicans ATCC®10231™, равноценные штаммы: IP 48.72™8, или NCPF® 3179™9, или NBRC®1594™ , или KCTC®7965™ , или другие равноценные местные коллекционные штаммы; - Aspergillus brasiliensis (устаревшее название A. niger) ATCC®16404™ , равноценные штаммы: IP 1431 , или IMI®149007™10, или NBRC®9455™ , или KCTC®6196™, или другие равноценные местные коллекционные штаммы. - Культура должна быть восстановлена в соответствии с процедурами, предусмотренными поставщиком референс штамма. Штаммы должны храниться в лаборатории, согласно EN 12353 или согласно другому подходящему методу. 5.4 Подготовка и учет калиброванных культур5.4.1 Общая информацияДля проведения испытаний выполняют пересев штаммов, которые хранят в лаборатории (см. 5.3), чтобы получить исходные культуры и рабочие культуры. Исходная культура – это конфлюэнтная культура, полученная путем посева культуры из хранилища штрихом на пробирки со скошенным агаром или чашки Петри с помощью одноразового шарика. После инкубации исходная культура может храниться при температуре от 2 °C до 8 °C до двух месяцев и применяться для получения рабочих культур. Из рабочей культуры, которую готовят непосредственно перед экспериментом, получают калиброванную суспензию (инокулят). Исходную и рабочую культуры выращивают в одинаковых условиях инкубирования, на одинаковой питательной среде (см. 5.4.2 и 5.4.3). П р и м е ч а н и е 1 – Ограничение количества последовательных пересевов и использование конфлюэнтных культур, а не изолированных колоний, снижает риск изменения восприимчивости штаммов. Стандартизация условий созревания и подготовки инокулята повышает повторяемость эксперимента. П р и м е ч а н и е 2 – Использование многоразовой посуды, которую хранят в замороженном виде, может привести к изменению восприимчивости штаммов, вызванному действием тепловых ударов. Это может произойти, если посуду вынимают из морозильного шкафа, из нее извлекают один шарик, а затем посуду возвращают в шкаф. 5.4.2 Подготовка суспензий бактерий и Candida albicans5.4.2.1. Для подготовки рабочей культуры испытываемого микроорганизма, необходимо подготовить субкультуру путем посева исходной культуры штрихом на пробирки со скошенным агаром или чашки Петри (TSA для бактерий, SDA для C.albicans), чтобы получить конфлюэнтную культуру. Выращивают при температуре (32,5 ± 2,5) °C от 18 до 24 ч. Таким же образом готовят вторую субкультуру путем посева первой культуры и выращивают при температуре (32,5 ± 2,5) °C от 18 до 24 ч. Третью субкультуру можно вырастить таким же способом путем посева второй культуры. Вторая культура и третья (если она была выращена) образуют рабочую культуру. Если нельзя получить вторую субкультуру своевременно, тогда допускается выдерживать первую культуру до 48 ч в инкубаторе при температуре (32,5 ± 2,5) °C, а затем использовать для подготовки второй субкультуры. В подобном случае готовят третью субкультуру, выращивая ее от 18 до 24 ч, и используют ее в испытании. Не рекомендуется готовить четвертую субкультуру из изначальной исходной культуры. 5.4.2.2 Берут 10 мл (см3) разбавителя (см. 5.2.2.2) и помещают в подходящую стерильную посуду со стерильными стеклянными шариками массой около 5 г. Переносят клетки, выращенные в агаризованной среде, в разбавитель с помощью петель для посева. Клетки суспендируют в разбавителе, потерев петлю с небольшим количеством разбавителя о стенку посуды, чтобы отделить клетки. 5.4.2.3 Гомогенизируют суспензию, встряхивая посуду вручную или механическим способом в течение 3 мин. Отбирают верхнюю часть суспензии с помощью аспиратора (избегая контакта со стеклянными шариками) и переносят полученную суспензию в стерильную посуду. 5.4.2.4 Регулируют концентрацию клеток в суспензии с помощью растворителя (см. 5.2.2.2) согласно данным о калибровке, полученным в лаборатории (например, с помощью спектрофотометра, см. ISO 21148, Приложение C). Концентрация должна составлять от 1 × 107 КОЕ/мл (КОЕ/ см3) до 1 × 108 КОЕ/мл (КОЕ/ см3) для бактерий и от 1 × 106 КОЕ/мл (КОЕ/ см3) до 1 × 107 КОЕ/мл (КОЕ/ см3) для C. albicans. Калиброванный раствор используют в течение двух часов. 5.4.2.5 При выполнении эксперимента проверяют исходную концентрацию клеток в суспензии, N. Выполняют серию десятикратных разведений калиброванной суспензии с помощью растворителя (см. 5.2.2.2). Выполняют подсчет количества клеток путем переноса 1 мл (см3) подходящих растворов (см. 5.6.2) в среду TSA для бактерий и SDA для C.albicans. Выращивают при температуре (32,5 ± 2,5) от 24 до 48 ч. 5.4.3 Подготовка взвеси спор A. brasiliensis (устаревшее название A. niger)5.4.3.1 Для получения рабочей культуры тест-микроорганизма готовят суспензию клеток исходной культуры (на PDA) не старше двух месяцев в растворителе (см. 5.2.2.2). Выполняют посев, залив суспензию на поверхность среды PDA, помещенной в колбу или подходящее количество чашек Петри, чтобы получить конфлюэнтную культуру. Выращивают при температуре (22,5 ± 2,5) °C от 7 до 11 дней. 5.4.3.2 После выращивания переносят 10 мл (см3) раствора полисорбата 80 (см. 5.2.2.2.3) в колбу. Осторожно отделяют споры от поверхности культуры, используя лопатку или стеклянные шарики. Переносят суспензию в подходящую колбу и осторожно перемешивают со стеклянными шариками в течение примерно 1 мин. Фильтруют суспензию с помощью фильтра из пористого стекла с пористостью 2 (от 40 до 100 мкм). 5.4.3.3 Выполняют микроскопирование (увеличение ×400), чтобы установить наличие проросших спор или фрагментов мицелия. - Если присутствуют проросшие споры, раствор считают непригодным для эксперимента. - Если мицелий обнаружен более чем в одном поле зрения из десяти, необходимо промыть отфильтрованную суспензию путем ресуспендирования ее в растворе полисорбата 80 (см. 5.2.2.2.3) с дальнейшим центрифугированием в течение 20 мин при 2000 g. Данную процедуру повторяют, по крайней мере, два раза. 5.4.3.4 Доводят концентрацию спор в суспензии до количества в пределах от 1 × 106 спор/мл (спор/см3) до 1 × 107 спор/мл (спор/см3) с помощью растворителя (см. 5.2.2.2) или другим подходящим способом. П р и м е ч а н и е – Для регулирования концентрации спор рекомендуется использовать прибор для подсчета клеток (например, гемоцитометр). Если используют счетную камеру, работу с ней осуществляют согласно инструкциям. Суспензию используют в день приготовления. Допускается использовать суспензию на следующий день, если она хранилась при температуре от 2 °C до 8 °C, но при этом следует повторно выполнить проверку на наличие проросших спор. 5.4.3.5 При выполнении эксперимента проверяют исходную концентрацию клеток в суспензии, N. Выполняют серию десятикратных разведений калиброванной суспензии с помощью растворителя (см. 5.2.2.2). Выполняют подсчет количества спор путем переноса 1 мл (см3) подходящих растворов (см. 5.6.2) на чашки Петри средой PDA , используя их подходящее количество. Выращивают при температуре (22,5 ± 2,5) °C от 3 до 5 дней. |
