Евразийский совет по стандартизации, метрологии и сертификации (еасс) euro-asian council for standardization, metrology and certification (easc)
|
5.5 Демонстрация эффективности нейтрализатора5.5.1 ПринципВыполняют проверку способности нейтрализатора в присутствии каждого микроорганизма нейтрализовать антимикробное действие тестируемого состава, не вызывая ингибирование роста тест-микроорганизмов. Калиброванную суспензию клеток микроорганизмов [примерно 103 КОЕ/мл (КОЕ/см3)] вводят в состав нейтрализатора с добавлением массы продукта (экспериментальный образец) и без добавления массы продукта (контрольный образец). Нейтрализатор считается эффективным, если количество клеток микроорганизмов в инокуляте Nv и в контрольном образце Nvn (смеси нейтрализатора и растворителя) эквивалентно, а количество микроорганизме в составе Nvf (смеси нейтрализатора и продукта) составляет не менее 50 % Nvn (см. 5.5.4). 5.5.2 ПроцедураВыполняют эксперимент отдельно для каждого штамма. a) Готовят раствор калиброванной суспензии клеток микроорганизмов [N от 1 × 107 КОЕ/мл (КОЕ/ см3) до 1 × 108 КОЕ/мл (КОЕ/ см3) для бактерий, и от 1 × 106 КОЕ/мл (КОЕ/ см3) до 1 × 107 КОЕ/мл (КОЕ/ см3) для C. albicans и A. brasiliensis (см. 5.4.2 и 5.4.3)], содержащий примерно 103 КОЕ/мл (КОЕ/ см3) (инокулят). b) Помещают 1 г или 1 мл (см3) испытуемого продукта в 9 мл (см3) нейтрализатора (см. 5.2.2.3). Перемешивают продукт путем встряхивания. При необходимости (т. е., если нейтрализатор окажется неэффективным), выполняют очередное десятикратное разведение в нейтрализаторе. Прочие условия эксперимента не нормируют. Единственным требованием является наличие не менее 1 г или 1 мл (см3) продукта, а также выполнение хотя бы одного десятикратного разведения. c) Оставляют пробирки с экспериментальным образцом в течение (30 ± 15) мин при комнатной температуре. Выполняют контрольное испытание, используя тот же нейтрализатор, заменив испытуемый состав 1 мл (см3) растворителя (см. 5.2.2.2). d) В пробирку с экспериментальным образцом [содержащую десятикратно разведенный состав, а если потребуется, то и более, см. 5.5.2 b)] и пробирку с контрольным образцом помещают по 1 мл (см3) инокулята [см. 5.5.2 a)]. Окончательный объем должен составить 11 мл (см3). Перемешивают. e) Готовят контрольный инокулят. Добавляют 1 мл (см3) инокулята [5.5.2 a)] к 10 мл (см3) растворителя. Окончательный объем должен составить 11 мл (см3). Перемешивают. f) В двух повторностях подсчитывают количество микроорганизмов в экспериментальном образце, контрольном образце и контрольном инокуляте, после культивирования в соответствующей питательной среде (TSA для бактерий, SDA для C. albicans и PDA для A. brasiliensis). П р и м е ч а н и е – Рекомендуется применять калиброванную суспензию объемом 1 мл (см3), так как это повышает точность счета количества микроорганизмов в смесях. g) Бактерии и C. albicans выращивают при температуре (32,5 ± 2,5) °C от 48 до 72 ч, A. brasiliensis выращивают при температуре (22,5 ± 2,5) °C от трех до пяти дней. 5.5.3 РасчетыПолучают Nv количество микроорганизмов, присутствующих в контрольном инокуляте [см. 5.5.2 e)] в КОЕ/мл (КОЕ/ см3). N – среднее количество колоний, подсчитанных на двух чашках Петри, содержащиеся в 1 мл (см3) контрольного инокулята; Ожидаемое значение Nv – около 100. Получают Nvf количество микроорганизмов, присутствующих в экспериментальном образце, состоящем из нейтрализатора и массы продукта, а также Nvn количество микроорганизмов в контрольном образце, не содержащем массы продукта. Показатели выражают в КОЕ/мл (КОЕ/ см3). Nvf и Nvn – это среднее количество колоний, подсчитанное в 1 мл (см3), соответственно, экспериментальных и контрольных образцов, на чашках Петри с соответствующей питательной средой; 5.5.4 Интерпретация результатов и получение вывода об эффективности нейтрализатора Нейтрализатор считают эффективным, если Nvf ≥ 0,5Nvn, а Nvn мало отличается от Nv. Если Nvn значительно отличается от Nv, то нейтрализатор считают токсичным по отношению к микроорганизмам. Следует принимать во внимание разброс результатов, полученных при подсчете количества колоний микроорганизмов, выросших на чашках Петри с соответствующей питательной средой. Два показателя обычно считают отличными друг от друга, если разница между ними превышает 50 %. Следует зафиксировать условия испытания (нейтрализатор, объем, и т. п.), а в особенности степень разведения продукта (1/10, 1/100 или другую), при которой показана эффективность нейтрализатора. Если результаты не соответствуют требованиям, выполняют следующее: - либо меняют нейтрализатор (см. Приложение C), либо выполняют разведение пробы, - либо выполняют фильтрование с помощью мембраны, если это возможно. Если и в таком случае результаты не соответствуют требованиям, маловероятно, что продукт может быть заражен испытуемым штаммом. Даже в таком случае, если это возможно, следует составить отчет об испытании [см. 5.7 и 5.8 f)]. |
